DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DEL pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

PRACTICA DE LABORATORIO 1

TEMA I: COMPOSICION DE LA MATERIA.

TITULO: DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DEL pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Tipo de práctica: Grupal (2 personas)

Duración: 2 horas

Indicaciones de peligro: No presenta indicadores de peligro. Se recomienda precaución en la manipulación de las sustancias y los utensilios de laboratorio.

Desarrollo de la actividad

1. Introducción al laboratorio.

1. Reconocimiento de la cristalería.
2. Selección y manipulación de las pipetas.
3. Prácticas de pipeteo

2. Determinación del pH mediante el método potenciométrico y el método colorimétrico.
3. Determinación de la capacidad amortiguadora de los Tampones

Objetivos

· Describir los medios, métodos y procedimientos, así como las reglas de comportamiento en las prácticas a desarrollar en clases de laboratorio de bioquímica.

· Determinar el pH de una solución utilizando métodos colorimétricos o potenciométricos.

· Reconocer la capacidad tampón de aminoácidos y proteínas.

· Relacionar los conocimientos adquiridos del funcionamiento de las soluciones tampón de importancia biológica.

Conceptos relacionados

Concepto de ácido-base, ionización del agua, definición de pH y pKa, ecuación de Henderson-Hassenbalch, capacidad tampón, valores de pKa de aminoácidos.

INTRODUCCIÓN.

La práctica contará con una parte teórico-práctica inicial, caracterizada por la explicación y demostración de las normas de trabajo en el laboratorio, la demostración de los principales instrumentos o cristalería y el uso de ellos así como de los equipos e instrumentos a emplear en las prácticas de laboratorio.

En el segundo tiempo los estudiantes desarrollarán sus actividades prácticas mediante la determinación de precursores en muestras problemas.

Para el buen desarrollo del trabajo es necesario seguir la marcha analítica, y continuar las orientaciones que posteriormente se detallan en cuando al orden de trabajo.

Fundamento teórico

El pH de una solución acuosa se define como el logaritmo negativo de la concentración molar de hidrogeniones (H₃O⁺). La determinación de pH es muy importante, ya que influye de manera directa en la carga de la molécula y en su actividad biológica. El producto iónico del agua es la base de la escala del pH propuesta por SΦrensen:

(k_w =[ H⁺] [ OH^-] = 10^-14, pH = -log [ H⁺]).

La escala de pH permite expresar la concentración de iones hidronio (protón hidratado) comprendida entre 1M y 1X10-14 M, extremos que corresponden a pH 0 y 14, la neutralidad es igual a pH 7.0.

La manera más conveniente y exacta de determinar el pH es usando un electrodo de vidrio. Este electrodo depende del intercambio de iones en las capas hidratadas formadas sobre la superficie del electrodo de vidrio.

Generalmente se utiliza vidrio compuesto aproximadamente 22% de Na₂O, 6% de CaO y 72% de SiO₂. Este vidrio muestra una especificidad hacia los iones hidrógeno hasta un pH cerca de 9; a valores mayores de pH, la membrana se vuelve sensible a iones sodio y otros iones alcalinos. Esto se evita empleando membranas construidas con vidrio en que el sodio se remplaza por litio. El electrodo de vidrio debe mantenerse en agua destilada o en solución de KCl saturada para evitar el crecimiento de microrganismos. En el electrodo de vidrio está presente un electrodo de referencia interno de plata/cloruro de plata (Ag/AgCl) rodeado por un electrolito de HCl 0.1M. Este electrodo de referencia interno produce un potencial estacionario.

El electrodo de vidrio actúa como una batería cuyo voltaje depende la actividad del H⁺ de la solución en que está sumergida. En el pHmetro, el electrodo de vidrio y el electrodo de referencia de calomel, están diseñados para que a pH 7 dé un potencial cero. Antes de medirse el pH de una solución desconocida el pHmetro se estandariza con soluciones amortiguadoras de pH conocidos.

El voltaje depende de la temperatura, por lo que los potenciómetros tienen un control de ajuste para la temperatura de la solución. Los electrodos de vidrio son frágiles y caros, por lo tanto deben manejarse con cuidado. Si se mide el pH de soluciones de proteínas, se puede formar una capa delgada en el electrodo la cual puede removerse sumergiendo en HCl 0.1N, y después limpiando con detergente diluido y enjuagando con agua.

Por otro lado, las soluciones amortiguadoras (“buffers” o soluciones tampón), son aquellas capaces de mantener el pH dentro de un rango de variación mínima. Están formadas generalmente por un ácido débil y su base conjugada cuando se trabaja a pHs por debajo de 7. En el caso de pHs alcalinos se usa una base débil con su ácido conjugado respectivo. La eficiencia de una solución reguladora está regida por dos factores: (a) La concentración total del regulador (suma de las concentraciones del ácido débil y de la sal). Cuanto más concentrado sea un regulador, más tolerante será a la adición de ácidos o bases fuerte. (b) Por la relación existente entre la base conjugada y el ácido. Cuando esta relación es igual a 1, la solución reguladora tiene su máxima eficiencia.

Este valor se alcanza cuando el pH del regulador es igual al pKa de ácido. La E=ecuación de Henderson y Hasselbalch, es muy útil para la preparación de las soluciones amortiguadoras. (pH = pKa + log [sal]/[Ácido]). El pH más adecuado para que una solución amortiguadora funcione eficientemente, es cuando se encuentra en un rango de pH igual a su pKa ±1.

Materiales

• 8 tubos de ensayo
• Pipetas (5-10 mL)
• Varillas de agitación
• 3 vasos de precipitados (50 o 100 mL)

Equipos

• PHmétro

Sustancias

• Soluciones tampón de pH 3,5,7,9 y 10
• NaOH 0.1 M
• Ácido ortofosfórico
• Indicador universal.
• HCl O.1 M
• Ácido bórico.
• Ácido acético glacial.
• Fosfato de sodio monobásico (NaH₂PO₄)
• Fosfato de sodio dibásico (Na₂HPO₄.7H₂O)

Procedimiento

1. Determinación del pH mediante el método potenciométrico.

1) Preparación de soluciones en un rango de pH de 3-10:

Pesar 0.5 g de ácido bórico y disolver en un 100mL de agua destilada, adicionar 560 µL de ácido ortofosfórico y 480 µL de ácido acético glacial, completar hasta 200 mL de agua destilada. El pH de la solución da alrededor de 1.9.

A partir de esta solución, a 25 mL de la solución anterior adicionar NaOH 0.2 M, con ayuda de una bureta, para obtener diferentes pHs. Realizar los cálculos teóricos del volumen de NaOH para obtener soluciones a pH 3,5, 7,9 y 10. Comparar estos datos con los obtenidos experimentalmente.

2) Preparación de una solución tampón de fosfato 0.1M a pH 7.0

A) Pesar 2.78 g de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4) y disolver en agua en un balón volumétrico de 100 mL, para obtener una solución de 0.2M.

B) Pesar 5.365 g de fosfato de sodio dibásico (Na₂HPO₄.7H₂O) o 7.17g (Na₂HPO₄.12H₂O) y disolver en agua en un balón volumétrico de 100 mL, para obtener una solución de 0.2M.

Mezclar 9,75 mL de la solución A con 15,25 mL de la solución B y diluir hasta 50 mL para obtener una solución tampón de fosfato 0.1M a pH=7.0.

La tabla 1 contiene los volúmenes de las soluciones A y B necesarios para obtener soluciones tampón de fosfato a diferentes pHs. Determinar el pH teórico y experimental.

Tabla 1. Relación entre los volúmenes de las soluciones A y B para obtener diferentes pHs.

2. Determinación del pH mediante el método colorimétrico.

1) Preparación de las soluciones con papel universal: Pesar 0.05g de naranja de metilo, 0,15g de rojo de metilo, 0.30g de azul de bromotimol, 0.35g de fenolftaleína y el 66% de alcohol etílico a un litro.

Escala estándar

Preparar una batería de 8 tubos de ensayo y colocar en cada tubo de ensayo 1mL de las soluciones preparadas en un rango de pH de 3-10. Adicionar 5 gotas de indicador universal y 9 mL de agua destilada.

Experimentación

Experimento I: Determinación del pH.

Tubo 1: 5 gotas de indicador+10 mL de agua

Tubo 2: 5 gotas de indicador+ 1 mL de solución tampón pH 7.0 + 9 mL de agua.

Tubo 3: 5 gotas de indicador+10 mL de agua

Tubo 4: 5 gotas de indicador+ 1 mL de solución tampón pH 7.0 + 9 mL de agua. Determinar el pH de cada solución y anotar los resultados en una tabla

Experimento II: Capacidad amortiguadora

Tubo 1: Adicionar una gota de NaOH 0.1M + 9 mL de agua destilada

Tubo 2: 9 mL de solución amortiguadora a pH= 7.0+ una gota de NaOH 0.1M

*Observar, determinar el pH y anotar en una tabla.

Soplar por 15 segundo el tubo 1 y por un minuto el tubo 2. Observar el cambio de color, determinar el pH (pHmetro) y anotar en una tabla.

Tubo 3: 9 mL de agua destilada+ 2 gotas de HCl 0.1M +

Tubo 4: 9 mL de solución amortiguadora a pH= 7.0+ 2 gotas de HCl 0.1M Observar, determinar el pH y anotar en una tabla.

Continuar adicionando gota a gota HCl 0.1M al tubo 4 hasta obtener el mismo color del tubo

• Determinar el número de gotas. ¿Qué pueden concluir?

Disposición de los residuos

Tabla 2. Disposición final de los residuos generados en la práctica.

Consultar antes de la práctica

1) Colocar en orden decreciente de acidez las siguientes soluciones: CH₃COOH 1M, agua, NaOH 1M y HCl 1M.

2) Calcular la [H⁺] y [OH^-] que están presentes en una solución de HCl 1 mM.

3) Calcular la concentración de protones, en mol/L, de una solución de ácido acético 1M, sabiendo que la Ka del ácido acético a 25°C es de 1.86*10-5.

4) Calcular el punto isoeléctrico de la Glicina sabiendo sus valores de pKa1=2.4 y pKa2=9.7.

5) Calcular el valor del pH de una solución de a) 1mM de H₂SO₄, b) 1mM de NaOH, asumiendo que en ambos los solutos están completamente ionizados. Cuál sería el valor del pH de la solución resultante de la mezcla de 25 mL de H₂SO₄ con 20 mL de solución de NaOH?

Referencias bibliográficas

1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.
2. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ; DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. Bioquímica: aulas prácticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p.
3. Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioquímica. Ediciones Omega. Capítulo 3 (2006).
4. Observaciones Oveimar.